СОЗДАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ТАКСИФОЛИН-СОДЕРЖАЩИХ КОЛЛАГЕН-АКРИЛОВЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ

Кожа, являясь самым большим органом человеческого тела, защищает организм от нежелательных воздействий окружающей среды, препятствуя проникновению загрязнений и развитию инфекций [1]. Огромное количество различных кожных заболеваний, тяжелых, острых и хронических ран, диктует поиск альтернативных и эффективных вариантов лечения. Для процесса лечения ран требуется сложный и ком-плексный подход, ключевым этапом которого является выбор оптимального перевязочного средства. Отдельным классом раневых повязок могут служить покрытия на основе гидрогелей. Гидрогели являются наиболее подходящим материалом для раневых повязок, применимы для традиционных целей и в тканевой инженерии в качестве скаффолдов для усиления регенерации поврежденных участков.

Гидрогели представляют собой нерастворимые в воде, но имеющие способность набухать в воде или реагировать на изменения, происходящие под воздействием окружающей среды трехмерные сетки, образованные посредством химических и/или физических связей [2]. Они могут поглощать большое количество воды благодаря наличию гидрофильных групп, таких как –OH, –CONH–, –CONH₂– и –SO₃H в структуре полимера [3].

Использование гидрогелевых материалов в биомедицине объясняется наличием у них уникальных свойств, таких как высокая газовая проницаемость, биосовместимость, способность сохранять влажную среду для заживления ран [4]. В частности, подобные материалы широко применяются в качестве раневых покрытий, так как имеют ряд преимуществ в сравнении с традиционными повязками [5].

Гидрогелевые повязки ускоряют заживление ран, контролируя уровень влажности в ране, поглощают и удерживают раневой экссудат, что способствует пролиферации фибробластов и миграции кератиноцитов [6, 7].

Сетчатая структура гидрогелей является матрицей для биологически активных молекул, например, антибиотиков, обеспечивающая транспорт лекарственного препарата в рану во время процесса высвобождения после контакта гидрогелей с поврежденным участком кожи [8–12]. Примером биологически актив-ных молекул, обладающих свойствами широкого спектра действия, является Таксифолин (дегидрокверцитин), входящий в группу флавоноидов, класс растительных полифенолов (рис. 1). Флавоноиды - пищевые добавки, понижающие риски возникновения рака, сердечно-сосудистых заболеваний, остеопороза и других возрастных дегенеративных заболеваний [13]. Таксифолин обладает антибактериальной активностью широкого спектра, сохраняя эффективность даже для антибиотикорезистентных бактерий [14]. Таксифолин способен ингибировать коллагеназы MMP-1, MMP-2 и MMP-9, отвечающие за деградацию коллагена, эластина и фибронектина кожи. Таким образом, таксифолин оказывает регенерирующее воздействие на кожные покровы [15, 16]. Кроме того, таксифолин проявляет дозозависимую антипролиферативную активность в отношении кератиноцитов, тем самым замедляя разрастание патологических новообразований [17].

Рис. 1. Структура таксифолина

В качестве основы для гидрогелевых повязок могут служить как синтетические так и природные полимеры, в том числе, с внедрёнными биологически активными молекулами. Независимо от природы поли-мера важными характеристиками являются биологическая активность, биоразлагаемость и биосовместимость. Гидрогели на основе акрилатов обладают высокой сорбционной способностью и биосовместимостью. Коллаген – фибриллярный белок, создающий на коже защитный влагоудерживающий слой, увлажняя её и поддерживая водно-липидный баланс. Коллаген биосовместим и обладает низкой антигенностью [18].

Предполагается, что совместное добавление коллагена и таксифолина в гидрогель будет оказывать синергетический эффект для заживления кожных покровов. Таким образом, разрабатываемая гидрогелевая матрица, содержащая таксифолин, может стать альтернативой современным раневым повязкам. Целью данной работы являлся синтез и исследование свойств таксифолин-содержащих коллаген-акриловых гидрогелей.

Материалы и методы

Акриловая кислота (ЗАО «Вектон» CAS 79-10-7), акриламид (ЗАО «Вектон» CAS 79-06-1), пероксидисульфат аммония (АО «ЛенРеактив» CAS 7727-54-0), N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин (Sigma-Aldrich, CAS 110-18-9), N,N’-метиленбисакриламид (ЗАО «Вектон», CAS 110-26-9), таксифолин (ООО «В-МИН», CAS 79-06-1), фосфатно-солевой буфер, таблетированный (ООО «Эко-Сервис»), коллаген (пище-вой), калия гидроксид (ЗАО «Вектон», CAS 1310-58-3), дистиллированная вода.

Методы

Акриловую кислоту и акриламид брали в соотношении 8:2. Коллаген по отношению к мономерам в соотношении 1:5. Содержание таксифолина по массе 0,5 % и 3 %.

Приготовление раствора таксифолина. Таксифолин измельчали в ступке до однородной массы и растворяли в этиловом спирте в соотношении 1:10.

Синтез гидрогелей

К 10 % раствору коллагена, растворённого в дистиллированной воде при 37 °С, добавляли предварительно нейтрализованную акриловую кислоту (степень нейтрализации акриловой кислоты 0,8). Смесь перемешивали на магнитной мешалке при 40 °С (температура, необходимая для начала полимеризации), и последовательно добавляли акриламид (при соотношении АК : ААм = 80:20 %), спиртовой раствор

таксифолина (концентрация 0,5 % к массе полимерной смеси), инициирующую систему: окислитель – пероксидсульфат аммония и восстановитель – N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин, в качестве сшивающего агента был использован N,N-метилбисакриламид с концентрацией 0,2 масс. % в расчёте на количество мо-номеров. Полученный гидрогель оставляли застывать без доступа света [19, 20].

Анализ методом ИК-Фурье спектроскопии

ИК спектры были зарегистрированы на Фурье-ИК спектрометре Tensor 37 фирмы Bruker с помощью приставки НПВО (нарушенного полного внутреннего отражения) MIRacle фирмы Pike с кристаллом из ZnSe с алмазным напылением. Регистрация спектров проводилась в диапазоне 4000–600 см^-1 с разрешением 2 см^-1 и усреднением по 32 спектрам.

Измерение сорбционной способности

Набухание гидрогелей проводилось в фосфатном буфере (pH=7,2–7,6) в течение пяти суток при комнатной температуре (25 °С).

Степень набухания рассчитывали по формуле:

 ,                                                        (1)

где m_s – масса набухшего образца, г; m₀ – масса высушенного образца, г.

Математическая модель Фика [21], характеризующая процесс набухания на начальной стадии набухания (до Q=0,6Q_max):

(2)

где Q_t и Q_∞ – степень и равновесная степень набухания, соответственно, представляющие собой количество растворителя, диффундировавшего в гидрогель в момент времени t и в бесконечное время (состояние равновесия), отнесенное к 1 грамму сухого вещества; k является константой, связанной со структурой полимерной сетки; n – число, определяющее тип диффузии.

Кинетическая модель сорбции псевдовторого порядка [22]. Уравнение кинетики псевдовторого порядка описывает скорость диффузии молекул растворителя массой, равной первоначальной массе полимерной структуры:

,                                                                   (3)

где k₂ – константа скорости сорбции модели псевдовторого порядка(г·(ммоль·мин) ^-1), t – время (мин).

Исследование высвобождения таксифолина из гидрогелевой матрицы

Высвобождение таксифолина из гидрогелевой матрицы проводили в растворе фосфатно-солевого буфера (pH=7,2–7,6). Калибровочный график строили с использованием данных, полученных на двухлучевом сканирующем спектрофотометре UV–Vis высокого разрешения Unico 2804, США. Спектры регистрировали в диапазоне 200–800 см^–1 при средней скорости сканирования.

Предварительно строили калибровочный график зависимости относительной оптической плотности от концентрации таксифолина в растворе таксифолин – этиловый спирт.

Долю высвободившегося из гидрогеля таксифолина рассчитывали по формуле [23]:

 ,                                            (4)

где  – масса таксифолина в растворе ПБС в момент времени;  – масса таксифолина, загруженного в гидрогель.

Для описания высвобождения таксифолина из гидрогелевой матрицы применяли модель Хигучи, мо-дель Корсмейера – Пеппаса, модель Бейкера – Лонсдейла и модель Хиксон – Кроуэлла. Математические выражения модели Хигучи (5), модель Корсмейера – Пеппаса (6), модели Бейкера – Лонсдейла (7) и модели Хиксон – Кроуэлла (8) [24– 26]:

• модель Корсмейера-Пеппаса описывает высвобождение лекарства из уравнения, основываясь на законе диффузии Фика для высвобождения лекарственных препаратов, распределенных в нерастворимой и набухающей матрице [27]:

(5)

где M_t, M_∞ – масса вещества, выделившегося в раствор в момент времени t загруженного в гидрогель, соответственно, г; K – константа в уравнении модели Корсмейера-Пеппаса; n – показатель диффузии;

• модель Хигучи используется для описания систем с контролируемым высвобождением лекарств в процессе диффузии c рядом допущений, использованных при построении модели [28, 29]:

 ,                                                                       (6)

где К_H – константа в уравнении модели Хигучи, f – масса выделенного вещества к времени t распределенная на площадь образца, г/мм²;

• модель Бейкера – Лонсдейла была разработана на основе модели Хигучи и описывает высвобождение из сферических матриц с помощью уравнения [30]:

 ,                                                       (7)

где M_t, M₀ – масса вещества, выделившегося в раствор в момент времени t и в момент начальный момент времени; K_BL – константа в уравнении модели Корсмейера-Пеппаса;

• модель Хиксон-Кроуэлла описывает высвобождение лекарственного препарата с учетом геометрии полимерной матрицы, принимая во внимание тот факт, что если размеры матрицы уменьшаются пропорционально, таким образом, что исходная геометрическая форма остается неизменной в течение всего про-цесса [31]:

 ,                                                               (8)

где K_HC – константа в уравнении модели Хиксон-Кроуэлла; W₀, W_t – масса вещества в начальный момент исследования и его остатка в образце к времени t, соответственно, г.

В ходе работы были получены композиционные гидрогели на основе полу-ВПС сополимера акриловой кислоты/акриламида и коллагена, наполненных таксифолином (концентрация таксифолина 0,5 %, рас-творенного в этаноле) методом свободнорадикальной полимеризации в водной среде. В процессе полимеризации нейтрализованная акриловая кислота была сшита с акриламидом с участием сшивающего агента N,N'-метилбисакриламид. Макромолекулярные линейные цепи коллагена встроены в акрилатный полу-ВПС сополимера акриловой кислоты/акриламида за счет электростатического притяжения. Время начала гелеобразования составило 13 мин, при этом полное застывание композитного гидрогеля произошло через 36 ч. ВНГ в настоящей работе было определено стандартным методом по потере текучести реакционной смеси.

На рис. 2 представлен ИК-спектр полимерного композита с концентрацией таксифолина 0,5 % . Широкая полоса поглощения относится к колебаниям валентных O–H групп (3296 см^-1), валентные колебания ассиметричных -СН₃ связей характеризуют полосы поглощения в диапазоне 2922–2851 см^-1.

Рис. 2. ИК-спектр таксифолин-содержащего коллаген-акрилового гидрогеля

Полоса поглощения в области 1741 см^-1 относится к колебаниям валентных карбоксильных групп С=О. Полоса поглощения при 1631 см^-1 соответствует поглощениям группы С=О акриламидных мономеров, а поглощение при 1546 см^-1 – карбоксилатным группам мономера акрилата калия. Полоса 1453 см^-1 характеризует валентные колебания С=С в ароматическом кольце флавоноида. Колебания С–О–С в группах =С–О–С– проявляются в области 1238 см^-1. Полоса при 1407 см^-1 характеризует колебания валентных СОО^- симметричных связей и полоса при 1104 см^-1 характеризует валентные С–N связи. Кроме того, наблюдаются полосы при 1338 см^-1 (между колебаниями O–H групп и колебаний C–O групп в фенольном соединении), 1120 см^-1 (типичная полоса в 5,7-дигидроксизамещенных флавоноидах) [32–36].

На рис. 3 представлены кинетические кривые набухания в фосфатно-буферном растворе гидрогелевого таксифолин-содержащего коллаген-акрилового композита при температуре 25 °С, степень набухания образцов достигает значения 50 г/г.

Рис. 3. Кинетические кривые набухания в фосфатно-буферном растворе таксифолин-содержащих коллаген-акриловых гидрогеля

В табл. 1 представлены некоторые сорбционные характеристики в фосфатно-буферном растворе (коэффициент диффузии (n), параметр сетки по Фику (k), константа скорости набухания по псевовторому порядку (k₂)) гидрогелевого таксифолин-содержащего коллаген-акрилового композита.

Математическая модель Пеппаса – Корсмейера описывает диффузию растворителя в гидрогелевую матрицу. Константа уравнения Фика характеризует скорость сорбции раствора гидрогелем на первоначальных стадиях набухания (до Q=0,6Q_max). Анализируя относительные скорости диффузии и релаксации поли-мерной структуры по степенному показателю n, можно сделать вывод о типе диффузии. Коэффициент диффузии n – для данного образца лежит в диапазоне 0,5–1,0, что указывает на нефиковский (аномальный) механизм диффузии, который описывает те случаи, когда скорости диффузии и релаксации полимерных цепей сопоставимы.

Таблица 1

Сорбционные характеристики таксифолин-содержащего коллаген-акрилового гидрогеля в фосфатно-буферном растворе (pH=7,2-7,6) при комнатной температуре (25 °С)

Кумулятивное высвобождение таксифолина из полимерной матрицы показано на рис. 4. Высвобождение таксифолина из опытных образцов было схожим и происходило в две стадии, минуя стадию быстрого высвобождения. Первая стадия проходила с постепенным высвобождением таксифолина из матрицы гидрогеля в течение 2000 мин. Вторая стадия соответствовала пролонгируемому высвобождению таксифолина (от 2000 до 3000 мин).

Рис. 4. Кумулятивное высвобождение таксифолина из коллаген-акриловой гидрогелевой матрицы

Параметры высвобождения таксифолина из гидрогелевой матрицы представлены в табл. 2. Показано, что модель Бейкера-Лонсдейла лучше всего соответствует данным по высвобождению согласно значению коэффициента корреляции (R²= 0,98).

Таблица 2

Параметры высвобождения таксифолина из коллаген-акриловой гидрогелевой матрицы

Получены композитные гидрогели на основе полу-ВПС сополимера акриловой кислоты и акриламида и коллагена, наполненных таксифолином, методом свободно-радикальной полимеризации.

Исследована зависимость времени начала гелеобразования от степени нейтрализации и температуры синтеза. Выявлено, что время начала гелеобразования составило 13 мин., при этом полное застывание композитного гидрогеля произошло через 36 ч.

Изучены сорбционные характеристики коллаген-акриловых композитов в фосфатно-солевом буфере.

Процесс сорбции растворителя в полимерную сетку описывается аномальной диффузией Фика.

Процесс высвобождения таксифолина описывается моделью Бейкера – Лонсдейла, при этом высвобождение проходит в две стадии.