СИНТЕЗ ХИТОЗАН-СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ И СВОЙСТВА ИХ КОМПОЗИТОВ

Введение

В прошлом веке в странах Западной Европы зародилась концепция «organic». Выросло стремление людей употреблять в качестве пищи только «экологически чистые продукты» и в настоящее время это стало своего рода трендом. Однако на птицефабриках и многих других животноводческих предприятиях обнаруживается чрезмерное применение антибиотиков, которые используют не только для лечения болезней животных, но также в целях профилактики и для стимулирования их роста. Неконтролируемое потребление антибиотиков животными имеет серьезные последствия для общественного здравоохранения, так как способствует появлению устойчивых к лекарствам бактерий и генов резистентности, которые могут быть переданы людям. Наиболее ожидаемой заменой антибиотикам могут послужить эссенциальные бактерицидные элементы. В качестве одного из таких элементов может выступать медь. Этот металл является одним из жизненно необходимых микроэлементов организма, поскольку принимает участие в процессах кроветворения, формирования и роста клеток, а также оказывает актив-ную помощь работе иммунной системы и обладает бактерицидными свойствами [1]. Медь имеет относительно доступную себестоимость, что позволяет использовать её в многотоннажных производствах. В наноразмерном виде медь обладает высокой физиологической активностью [2], поскольку свободно проникает во все органы и ткани. Таким образом, использование меди в виде наночастиц (НЧ) позволит

ей активно стимулировать рост животных и оказывать иммуномодулирующее действие на организм, не уступая по эффективности антибиотикам.

Актуальна проблема стабилизации высокоактивных НЧ меди и их транспортировки из полости кишечника в кровь при пероральном приёме. Перспективным стабилизатором НЧ является хитозан (ХТЗ) – биоразлагаемый биосовместимый полисахарид. Макромолекулы ХТЗ имеют в растворе кон-формацию жесткого стержня или полугибкого клубка, в зависимости от разных факторов. В растворе с pH среды менее 3,5 макромолекулы полимера являются сильно протонированными, более гибкими и могут принимать конформацию клубка [3]. В области pH среды 4,5-5,5 макромолекулы ХТЗ являются жесткими стержнями, поскольку непротонированные аминогруппы образуют внутри- и межмолекулярные связи с атомами кислорода в цепях [4]. Различная конформация макромолекул ХТЗ может оказывать влияние на размер формирующихся НЧ и свойства образующихся нанокомпозитов [5, 6].

Доказана возможность использования ХТЗ в качестве матрицы-стабилизатора лекарственных средств при доставке непосредственно в кровь. Мукоадгезивные свойства полисахарида способствуют удержанию биокомпонентов на поверхности слизистых мембран, что увеличивает их терапевтический эффект и позволяет проникать лекарствам в ткани и клетки [7]. Производство некоторых препаратов, в основу которых входит ХТЗ, уже успешно налажено. Во ВНИТИБП на базе ЗАО «Биопрогресс» освоен выпуск хитозансодержащих биологически активных добавок к пище «Хитан», «Полихит», «Фитохитодез-02». Имея водорастворимую форму благодаря ХТЗ, такие препараты вызывают пролонгирующее действие лекарственных компонентов растений и усиливают их воздействие на организм [8].

Известны различные способы получения НЧ меди, в том числе в растворах ХТЗ [9–11]. Наиболее распространенным методом получения НЧ является химическое восстановление [12, 13]. Однако с точки зрения биомедицинских приложений системы ХТЗ-НЧ меди более предпочтительными являются

«зеленые» методы синтеза, так как не требуют введения токсичных восстановителей. Интересно получение НЧ меди микроволновым способом, поскольку методика весьма эффективна при наименьших временных и энергетических затратах [14].

Целью данного исследования стало синтезирование НЧ меди стабилизированных ХТЗ, путем микроволнового воздействия, установление влияния конформационного состояния макромолекул полисахарида на размерные характеристики НЧ, исследование свойств полученных композиций.

Экспериментальная часть

В исследовании были использованы следующие вещества:

ХТЗ – поли((1,4)-2-амино-2-дезокси)-β-D-глюкоза, без дополнительной очистки, полученный из панцирей краба (ОАО «Биопрогресс», г. Москва, Россия) с молекулярной массой 4×10⁵, степенью деацетилирования 0,96.

Для приготовления растворов ХТЗ использовали уксусную кислоту марки «ХЧ» ГОСТ 61-75 (99,5 %, плотность 1,049 г/см³).

В качестве восстановителя НЧ меди использовали аскорбиновую кислоту (АК) марки «ЧДА».

СТП ТУ КОМП 2-723-15 – белый кристаллический порошок, без запаха, светочувствительный.

Прекурсором – источником ионов меди послужил дигидрат хлорида меди марки «ЧДА». ГОСТ 4167-74 (99,5 %). Т_пл = 110 ^оС, ρ = 2,38 г/см³.

Высаживание полученных композиций проводили изопропиловым спиртом ГОСТ 9805-84 (ЗАО

«Химреактив»).

НЧ меди получали в водно-уксусных растворах 3 мас. % ХТЗ с использованием восстановителя – аскорбиновой кислоты (0,038 М). Концентрация уксусной кислоты в растворах составляла 1,2 % (рН среды – 3,3) и 6 % (рН среды – 4,8). Источником НЧ был водный раствор 2 мас. % дигидрат хлорида меди. Далее полученные растворы подвергали микроволновому воздействию мощностью микроволн 900 Вт на короткие промежутки времени. О восстановлении ионов меди и формировании НЧ судили по регистрации через определенные интервалы времени спектров поглощения разбавленных в 20 раз растворов на спектрофотометре УФ – и видимого диапазонов UV-1650 (Shimadzu). Наблюдали появление и нарастание полос поглощения, соответствующих плазмонному резонансу НЧ меди (λ ~ 585–600 нм) до тех пор, пока величина максимума поглощения не переставала изменяться [15]. Во всех опытах процесс формирования НЧ меди в растворах ХТЗ проводили по одному алгоритму.

Композиции исследовали методом ИК-спектроскопии на приборе ИК-Фурье-спектрометр Infralum «ФТ-801». Образцы получали из соответствующих растворов путем высаживания изопропиловым спиртом и высушивали вакуумированием при 50 °С до постоянной массы. Сухие образцы нанокомпозитов и ХТЗ измельчали до мелкодисперсного состояния с KBr в соотношении образец/KBr 1:20 и

формировали таблетки с помощью воздушно-гидравлического пресса при давлении 400 кг/см². ИК-спектры образцов снимали в режиме пропускания в диапазоне частот 400–4000 см^-1.

Устойчивость дисперсий НЧ меди в растворах ХТЗ оценивали по величине электрокинетического потенциала. Электрофорез разбавленных дисперсий НЧ меди проводили на приборе Кёна при разности напряжений между электродами 220 В и силе тока 6,3 мА. ξ-потенциал рассчитывали по формуле (1)

;                                                                   (1)

где U – напряжение, В; t – время от начала перемещения частиц дисперсной фазы к одному из электро-дов, с; l – расстояние между электродами, м; S – путь, пройденный НЧ, м; ε₀ – электрическая константа. 8,85×10^-12 Ф/м; ε – диэлектрическая проницаемость воды; η – вязкость, Па×с.

Структура порошкообразных ХТЗ и его нанокомпозиций была исследована с помощью РФА-анализа образцов на рентгеновском дифрактометре «Bruker D8 Discover» с использованием CuKa излучения и детектора LynxEye с шагом сканирования 0,02°, в интервале 2θ 10-60°. Точность определения дифракционных углов (2θ) составляла ±0,02°. Оценку интенсивности дифракционных максимумов проводили по их высоте (100 – бальная шкала).

Теплофизические свойства нанокомпозиций, содержащих НЧ меди, изучали методом ДСК на приборе DSC 500 (Россия). Измерения температуры стеклования (T_g) и деструкции (T_d) образцов осуществляли после предварительного цикла нагревания и охлаждения до 105 °C для удаления воды из исследуемых образцов. За T_g и Т_d принимали температуру, соответствующую середине отрезка ДСК-кривой композитов в интервале их стеклования и деструкции.

Результаты и их обсуждение

Наиболее известным способом получения НЧ меди является химическое восстановление, а перспективный подходом к данной ситуации заключается в подборе такого восстановителя, который отвечал бы всем стандартам экологичности и биосовместимости. Важно не просто получить данные НЧ, но и предотвратить их переход в другую форму, поскольку медь окисляется до оксидов при контакте с кислородом воздуха. Решением проблемы может выступать синтез НЧ меди в полимерной матрице – ХТЗ, который обладает эффективными стабилизирующими свойствами.

Синтез НЧ меди провели в условиях микроволнового излучения в растворах полимера-стабилизатора. Использовали растворы ХТЗ с различными конформациями: клубка и жесткого стержня. Кине-тику образования НЧ, стабилизированных ХТЗ, контролировали спектрофотометрически по появлению и нарастанию интенсивности полос поглощения, соответствующих плазмонному резонансу НЧ меди: λ ~ 585-600 нм [15]. Следует отметить, что для всех систем с различными конформациями полисахарида кривые полос плазмонного поглощения носили однотипный характер и отличались лишь положением максимумов (табл. 1). На рис. 1 представлены типичные спектры растворов.

Рис. 1. Полосы плазмонного поглощения НЧ меди, полученных в растворах ХТЗ с конформацией макромолекул – клубок (рН ~ 3,3): 1 – 30 с, 2 – 60 с, 3 – 90 с, 4 – 120 с; λ_max = 591 нм

В табл. 1 приведены значения длин волн максимумов полос поглощения НЧ меди при различных конформациях макромолекул ХТЗ в растворах.

Таблица 1

Значение длин волн максимумов полос поглощения НЧ меди при различных конформациях макромолекул ХТЗ в растворах

Из данных табл. 1 видно, что для конформации макромолекул ХТЗ – жесткий стержень наблюдается смещение положения максимума полос поглощения НЧ меди в более коротковолновую область, по сравнению с НЧ, полученными в растворах с конформацией макромолекул – клубок. Известно [16], что чем больше значение длины волны максимума полосы плазмонного поглощения НЧ, тем больше их размер. Несмотря на то, что разница в величине максимумов растворов незначительна, стабильные результаты при неоднократных повторениях синтеза НЧ исключают погрешность измерения.

Существует много мнений о причине смещения полос плазмонного резонанса металлических НЧ с уменьшением их размера [17]. Вероятнее всего, при взаимодействии прекурсора НЧ с полимером-стабилизатором, ионы меди посредством электростатических взаимодействий соединяются с макромолекулами ХТЗ. Атомы кислорода, имеющие свободные электроны полярных гидроксильных и эфирных групп ХТЗ, возможно, вступают во взаимодействие с положительно-заряженными катионами меди [18]. То есть ХТЗ выступает не только стабилизатором, но и регулирует процесс флуктуации [19].

Был выполнен анализ ИК-спектров для оценки молекулярных взаимодействий между макромолекулами ХТЗ и НЧ меди. Полученные результаты позволяют доказать, какие функциональные группы ХТЗ участвуют в стабилизации НЧ меди. Характерные полосы валентных колебаний групп полисахарида наблюдались в ИК-спектре при 3350 см^-1 (из-за перекрытия растяжения О-Н и N-Н); 1560 см^-1 (рас-тяжение С=О); 1410 см^-1 (изгиб С-Н); 1154 см^-1 (растяжение С-О-С); 657 см^- (растяжение С-Н) (рис. 2). Четкое смещение полос в области валентных колебаний представлены выше групп ХТЗ, содержащих свободные электронные пары, которые способствуют адсорбции НЧ на полимере. Пик при 657 см^-1 указывает на наличие взаимодействий между ХТЗ и НЧ меди, это говорит о том, что НЧ покрыты полисахаридом [20, 21].

Рис. 2. ИК-спектры композитов: 1 – ХТЗ-НЧ меди; 2 – ХТЗ

Была исследована агрегативная устойчивость дисперсий НЧ меди. Поскольку ХТЗ является поликатионитом, об агрегативной устойчивости дисперсий можно судить по величине электрокинетического по-тенциала (ξ) систем. Известно, что критическое значение ξ-потенциала коллоидных частиц, определяющее начало их агрегации, составляет 25–30 мВ [22]. Электрокинетический потенциал дисперсий НЧ меди составил 38 мВ (для раствора с конформацией макромолекул ХТЗ – клубок) и 53 мВ (для раствора с конформа-цией макромолекул ХТЗ – жесткий стержень), что говорит об их агрегативной устойчивости.

Методом РФА исследована структура порошков композиции ХТЗ-НЧ меди и определены размерные характеристики НЧ (рис. 3). Показано, что в порошках наблюдаются кристаллические структуры.

Рис. 3. Рентгеновские дифрактограммы нанокомпозитов, полученных из растворов с конформацией макромолекул хитозана: 1 – клубок, 2 – жесткий стержень

По результатам РФА определены размеры НЧ меди: для конформационного состояния макромолекул ХТЗ – клубок ~ 25 нм. Размер НЧ для ХТЗ с конформационным состоянием макромолекул – жесткий стержень составил ~ 22 нм. По-видимому, НЧ меди в растворах со спиральной конформацией макромолекул ХТЗ формируются меньших размеров из-за нехватки свободного пространства для роста числа атомов в НЧ, поскольку межмолекулярный объем в таком полимере меньше, чем в клубке, из-за большего количества водородных связей между цепями полисахарида. В конформации клубка аминогруппы полисахарида сильнее протонируются, следовательно, количество водородных связей уменьшается, и в такой конформации макромолекул ХТЗ увеличивается их межмолекулярный объем, способствующий большему росту НЧ меди.

Были исследованы теплофизические свойства композиций (рис. 4).

Рис. 4. ДСК-кривые хитозана с конформацией макромолекул: 1 – клубок, 2 – жесткий стержень; и его композитов с НЧ меди: 3 – клубок; 4 –жесткий стержень.

ХТЗ во всех образцах находился в ацетатной форме. Соответствующие температуры стеклования (T_g) и начала термической деструкции (T_d) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Теплофизические характеристики исследуемых кривых

* Погрешность в определении T_g и T_d составляет ± 1 °C

Показано, что введение НЧ меди в состав композита существенно смещает температуры стекло-вания и деструкции полимера в низкотемпературную область – на ~ 20 и 47 °C, соответственно. Возможно, уменьшение температуры стеклования нанокомпозита по сравнению с полимерной матрицей объясняется формированием рыхлой упаковки переходного слоя между полимерной матрицей и НЧ – так называемым эффектом пластификации [23]. Кроме того, в объеме нанокомпозита возникает массив нагревательных элементов из токопроводящих частиц. В результате диффузионные процессы переноса тепла в непроводящей матрице протекают на более малых расстояниях, происходит более быстрое

«размораживание» сегментов макромолекул матрицы, и, соответственно, понижение температуры стеклования относительно полимера-носителя.

Заключение

Композиции ХТЗ-НЧ меди со средними размерами от 22 до 25 нм успешно получены в условиях микроволновой активации. Стоит отметить, что данная методика отвечает всем стандартам экологичности и биосовместимости, поскольку стабилизатором является биополимер – ХТЗ, а восстановителем аскорбиновая кислота – витамин С. Результаты исследований указывают на потенциал НЧ меди, стабилизированных ХТЗ, в качестве возможной замены ими антибактериальных препаратов в кормах животных.